做磷酸化抗体试验时难免会有这样的困惑，对于常见的p-Akt（Thr308）和p-Akt（Ser473）位点，到底该选择哪个？关于这个问题，作为磷酸化抗体领导者的CST及CST中国（赛信通）科研团队可以助你一臂之力。
CST赛信通关于磷酸化抗体Autophagy Signaling信号通路图
在分享来自CST及CST中国（赛信通）关于的答案之前，先来了解下Akt家族。Akt也被称为蛋白激酶B(proteinkinaseB，PKB)，是一种分子量约为60kDa的丝/苏氨酸蛋白激酶，存在于哺乳动物中的三种同工型。AKT可分为3种亚型(AKT1、AKT2、AKT3或PKBα,PKBβ,PKBγ)，3种亚型的功能各异，但也有重叠。AKT1广泛地分布在组织中，Akt2主要分布在肌肉和脂肪细胞中，而Akt3则在睾丸和大脑中表达。Akt调控多个生物过程，包括细胞存活、增殖、生长和糖原代谢，Akt信号通路与恶性肿瘤、糖尿病、类风湿关节炎等多种疾病的发生发展密切相关，越来越受到广泛的关注。
许多生长因子、激素与细胞因子通过结合其同源受体酪氨酸激酶(RTK)、细胞因子受体或GPCR，以及通过触发脂质激酶PI3K的活化来激活Akt，从而在细胞质膜中生成PIP3。Akt通过其普列克底物蛋白同源(PH)结构域与PIP3相结合，导致Akt转位至细胞膜。通过双磷酸化机制，可以激活Akt。同样因为自身PH结构域而转位至细胞膜的PDK1，能够活化Akt的Thr308位点使Akt磷酸化，PDK2再对Akt的Ser473位点磷酸化才能最后导致其完全活化，也就是说羧基末端Ser473位点的二次磷酸化对于活性来说也是必要的，并由mTOR-rictor复合体mTORC2完成，活化的Akt引起下游磷酸化级联反应和靶蛋白之间的相互作用。
CST赛信通关于磷酸化抗体MAP Kinase Signaling信号通路图
那么，CST及CST中国（赛信通）对于做磷酸化抗体时，磷酸化Akt位点的选择有什么样的建议？细胞许多生物学功能中，PI3K/Akt信号通路发挥重要的调控作用，在细胞内起抑制凋亡，促进增殖的作用。作为PI3K的下游蛋白，Akt主要有两个重要的磷酸化位点Thr308和Ser473。PI3K不能直接活化Akt，它是通过与细胞内含有PH结构域的信号蛋白Akt和磷脂酰肌醇依赖激酶1（phosohoinositide-dependentkinase1，PDK1）结合，诱导Akt到细胞膜上，然后催化Akt蛋白的Thr308位点发生磷酸化，从而部分激活Akt，但是Akt功能活性的充分发挥还需要Ser473的磷酸化。在许多细胞系（尤其是肿瘤细胞系）中，对Akt功能的抑制多是通过抑制PI3K的功能（如使用PI3K特异性抑制剂LY294002和Wortmannin）而实现的，以p-Akt（Ser473）表达含量的降低为主要指标。PTEN蛋白是PI3K/Akt信号通路的主要负调节蛋白，拮抗PI3K和Akt，使PIP3脱磷酸，通过抑制Akt磷酸化并使其去磷酸化，使得细胞中的Akt磷酸化水平降低，从而阻断PI3K/Akt信号通路，抑制细胞生长，促进细胞凋亡。
CST赛信通关于磷酸化抗体p53 Signaling信号通路图
Thr308和Ser473两个位点的激酶可能不同，PDK1磷酸化Akt308，而mTOR激活Akt473，一些研究表明Thr308的磷酸化会促进Ser473的磷酸化，因为AKT激活的磷酸化顺序一般是先Thr磷酸化后Ser磷酸化，即Thr磷酸化后Akt一般都激活了。膜上的PDK1在AKt的Thr308位点将其磷酸化，导致Akt的部分激活。Ser473位点被mTORC2磷酸化，可激发Akt的完全的酶活性。在选择位点的时候，可以从作用的激酶来推测哪一个位点可能会发生变化，最直接的位点是检测Ser473，如果两者都检测的话那自然是比较好的。
CST及CST中国（赛信通）还有一个做磷酸化抗体的建议，即看看这两个位点发生磷酸化修饰对生物学功能的影响。如果是做细胞凋亡、细胞周期、细胞骨架重组、癌症相关的话，Thr308和Ser473两个位点都可能参与其中；如果研究细胞分化，可能需要多关注下Ser473位点；和蛋白降解相关的一般是Ser473位点；在非小细胞肺癌的研究中，可能与Thr308位点的磷酸化高度相关。但是必须要注意的是，信号通路错综复杂，最好还是结合文献，来推测所需检测的磷酸化308位点。
CST赛信通关于磷酸化抗体Phosphoinositide Signaling信号通路图
据悉，CST（Cell Signaling Technology)是一家由科学家创立的私营家族公司，CST中国（赛信通）是CST在中国建立的独资子公司，Jay Dong（董增军）为副总裁兼亚太地区总经理。CST被公认为细胞信号研究的金标准、最佳抗体、研究者的首选、PTM（蛋白翻译后修饰）的领导者、2018最高引用抗体品牌等。
CST赛信通关于磷酸化抗体Warburg Effect信号通路图
CST提供最高品质的特色信号蛋白及磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、SUMO化等翻译后修饰抗体，蛋白翻译后修饰筛选试剂盒及服务，还有偶联抗体，二抗，ChIP试剂盒，细胞因子，ELISA试剂盒，细胞检测试剂盒，蛋白实验配套试剂等，提供蛋白相关实验的一站式解决方案。
