随着对肿瘤等疾病的深入认知，人们有越来越多的靶向药物可以选择，达到良好的疾病缓解效果。在临床病理和基础科研的工作中，需要对大量不同样本进行一系列靶蛋白和生物标志物免疫检测。免疫组织化学作为常规病理检测手段，是很多疾病检测的“金标准”，不仅能够辅助指导疾病分型，作为靶向用药的依据;而且因其能还原组织形态、找准靶点细胞亚定位信息，在临床前研究中也发挥着不可替代的作用。基于酪胺信号放大的荧光多重免疫组织化学法(mIHC) 是研究免疫肿瘤学的一种有价值的工具，能够在福尔马林固定、石蜡包埋的 (FFPE)组织样本中检测6种或更多种蛋白质/生物标志物。
CST赛信通关于免疫组化Death Receptor Signaling信号通路图
CST赛信通关于免疫组化Energy Metabolism信号通路图
作为一家专注于信号转导领域的公司，CST中国一直站在转化医学研究的前沿，全力为广大研究者提供创新型的解决方案及试剂，让CST中国的专家告诉你：做多重荧光简单，有种多快好省的方法。
这种方法就是TSA技术(Tyramide Signal Amplification™，酪胺信号放大技术)：简单来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP(而不是直接偶联荧光素)，来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素还留存在样品上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。
由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，如果用TSA技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行实验，而且信号放大的倍数大大增强。
荧光法多重免疫组化，可同时进行五个颜色通道以上，这种情况下发射光谱会重叠，我们可以借助多光谱成像系统来解决这个问题。这是传统间接荧光法染色和显色法多重免疫组化所做不到的。这种方法能真实反映关键蛋白的表达情况和相互之间的关系，从而极大地节约珍贵的样品。
使用TSA技术，你需要准备：
1、严格验证的高特异性抗体：所有CST的IHC-P验证过的抗体都满足mIHC(多重荧光免疫组化)高特异性的要求
2、HRP偶联的针对一抗种属亚型特异的二抗
3、酪胺荧光素(PerkinElmer, Thermo Fisher Scientific等供应商)
4、多光谱成像系统(PerkinElmer等)
四事具备，你就可以开始尝试进行TSA的多重荧光组化染色了。如何做到呢?除了优质的抗体，还需要优化的实验方案和抗体配比，比如：如何配比抗体，如何选择荧光素等。
解读一下CST中国采用的基于TSA的mIHC 实验优化原则应用手册
基本方法
1.切片脱蜡、复水
2.抗原修复：优化抗原修复流程，尽可能最大程度修复抗原。
3.抗体浓度优化：染色前优化抗体稀释度，提高每一个靶点的检出率和信噪比。
4.染色：用SignalStain® Antibody Diluent #8112稀释一抗，然后用对应的SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125 或(HRP, Rabbit) #8114作为二抗孵育，使用荧光素反应染色。
5.拍照分析：用Nuance® 多光谱成像系统(PerkinElmer公司)拍摄，也可使用其他多光谱成像系统如Vectra®, Mantra® 等。并用配套inForm® Tissue FinderTM 模式识别软件进行成像分析。
结果
1.抗体稀释优化
多重染色之前，先摸索单通道下每一个单抗的最佳浓度范围。以PD-L1抗体为例，通过梯度稀释抗体，测试阴性(PC-3)和阳性(Karpas-299)样本的荧光强度，计算信噪比(S/N)和最高荧光强度(以每细胞平均荧光强度表示)同时能满足的稀释比例/范围。
2.抗体-荧光素匹配
多重染色需要平衡待检样品中靶点峰度和各通道信号强度。通过此步矩阵式优化尽量做到：寡靶配强光，众靶配弱光。
3.染色顺序优化
TSA原理的多重荧光免疫组化中，由于染料是依次共价偶联在切片上的，并需要通过加热洗去前续抗体，因此需要确定染色顺序，以保证：A.多次加热切片不会影响后续靶点表位完整性;B.前续偶联的荧光素能耐受后续加热过程。
基于以上荧光素染色要点，我们可以将原来确定染色顺序的排列问题=120种情况，简化成5 x 5=25优化测试方案。针对每一个抗体-荧光素匹配通道，根据以下表格来进行摸索：
例如，分别针对每一个抗体进行如下测试：第一位染色顺序的测试中，切片PD-L1抗体孵育，Cy5®染色前已经进行了抗原修复加热一次;在孵育之后，再微波加热处理5次。第五位染色顺序的测试中，切片PD-L1抗体孵育之前，微波加热5次，孵育之后，然后再微波加热一次。这样的测试矩阵能够测定抗体、荧光素的结合能力和稳定性。
4. 构建多光谱库
在多色模式下，每一靶点自身产生的荧光素信号和同一组合中其他相关荧光素产生的信号同时被收集构建一个光谱库， 进行线性分离分析。简单来讲，需要让分析软件认识多色模式中每一个荧光素的发射光谱，从而将针对特定靶点的真实信号同其他荧光素产生的信号区分开。并将每一个荧光素信号附以伪彩，黑色伪彩被定义为样本自发荧光，则可以在最后图像采集和处理时将信号减掉。
5.单通道和多通道信号对比
为了进一步优化和理解多通道染色对真实信号的影响，可以进行多色和单色染色的对比。为避免处理的差异，所有的切片都进行了同样的加热和冷却处理。
6.显色法和荧光法对比
进一步比较不同原理的染色方法，确定验证不同靶标表达范式和表达量的真实性。图中非连续切片，视野不同。请留意箭头处的表达位置。
7.多通道染色(5个靶点+核复染)
此组合能够展现出肿瘤上皮细胞(CK)、肿瘤微环境和肿瘤浸润淋巴细胞的空间关系，可以为PD-L1疗法和肿瘤免疫评分提供重要参考。
结论
TSA技术下多重荧光免疫组化相比传统的多重荧光而言，具有：信号放大倍数高、简化抗体选择、易于设计优化、超多通道同时检测、全景展示蛋白表达特征、节约样品等诸多优点。而且CST所有IHC-P验证过的抗体都可以用在这类应用中，随着技术的推广，更多应用手册的更新，必将得到更广泛的应用。
CST赛信通关于免疫组化PI3 KinaseAkt Signaling信号通路图
CST研发科学家利用CST的优质抗体，在这个领域也花了很多功夫来尝试，希望给广大科研工作者更详细的实验方案，为大家的研究铺平道路。强大的研发团队目前已经将已有方案优化到了7色!所以荧光染色染出七色光再也不是传说!
